Thử nghiệm Lecithinase (phản ứng Nagler)

187

Thử nghiệm lecithinase hay phản ứng Nagler là xét nghiệm sinh hóa dùng để xác định các sinh vật giải phóng phospholipase (lecithinase) ví dụ như Clostridium perfringens . Độc tố alpha (α) của C. perfringens có hoạt tính phospholipase và do đó, giúp phân biệt C. perfringens với các Clostridium spp khác cũng tạo ra lecithinase ( C. baratti, C. absonum, C. bifermantans, C. sordelli và C. novyi ) bằng cách trung hòa hoạt động của lecithin c bằng chất kháng độc tố.

Thử nghiệm Lecithinase

Bacillus cereus cũng thể hiện hoạt tính lecithinase mạnh. Phân biệt bằng đặc tính tan máu mạnh trên môi trường thạch máu cừu và khả năng vận động. Trong số các loài Bacillus, B. thuringiensis và B. anthracis có lecithinase dương tính hoặc dương tính yếu. Tuy nhiên, B. anthracis là sinh vật không di động và tạo ra các khuẩn lạc không tan máu.

Nguyên tắc thử nghiệm Lecithinase

Lecithin là thành phần bình thường của lòng đỏ trứng. Lecithinase của vi khuẩn phân hủy lecithin thành lecithinase thành phosphorylcholine và diglyceride không hòa tan, tạo thành kết tủa trong môi trường. Kết tủa này xuất hiện dưới dạng quầng sáng trắng đục bao quanh khuẩn lạc sinh lecithinase phát triển trên môi trường thạch lòng đỏ trứng.

Thạch lòng đỏ trứng biến tính là môi trường tăng sinh và phân biệt. Được sử dụng để phân lập và phân biệt các loài khác nhau. Dựa trên khả năng sản xuất lecithinase và lipase cũng như hoạt động phân giải protein của chúng. Sự phân hủy lecithin có trong lòng đỏ trứng dẫn đến hình thành kết tủa mờ đục quanh khuẩn lạc. Enzim lipase thủy phân chất béo trong lòng đỏ, tạo ánh sáng óng ánh trên bề mặt khuẩn lạc. 

Môi trường thử nghiệm Lecithinase

Môi trường lòng đỏ trứng cơ bản được chuẩn bị bằng cách hòa tan lượng tiêu chuẩn trong nước cất. Trong đó 10% lòng đỏ trứng được thêm vào sau khi hấp.Làm nguội môi trường trước khi phân phối vào đĩa Petri vô trùng.

Kiểm soát chất lượng

Kiểm tra thạch lòng đỏ trứng xem có bị đóng băng, nhiễm bẩn, nứt và mất nước trước khi bảo quản và sử dụng.

Loại bỏ môi trường mờ đục. Thực hiện QC trên từng lô phương tiện mới trước khi sử dụng chúng.

Các chủng sau đây có thể được sử dụng để kiểm tra chất lượng trong phản ứng Naglers

  • Clostridium perfringensATCC 13124 – Lecithinase dương tính
  • Clostridium sporogenesATCC 11437 – Lecithinase âm tính
  • Bacteroides fragilisATCC 25285 – Không hoạt động trên thạch

Quy trình thử nghiệm

  1. Dán nhãn và làm khô đĩa đựng lòng đỏ trứng rồi đánh dấu đĩa thành hai nửa.
  2. Cấy 60 µl chất kháng độc tố Clostridium perfringensloại A vào một nửa đĩa. Dàn đều trên bề mặt thạch bằng máy rải và để cho hấp thụ và khô.
  3. Đánh dấu mặt của đĩa nơi chất kháng độc tố được cấy vào.
  4. Ria sinh vật thử nghiệm theo một đường thẳng từ nửa đĩa thạch không chứa độc tố đến mặt chứa độc tố. Lặp lại quy trình tương tự với các chủng đối chứng trên cùng một đĩa.
  5. Ủ kỵ khí ở 35-37°C trong 24-48 giờ.
  6. Kiểm tra đĩa xem có quầng sáng trắng xung quanh chất cấy và sự ức chế của chất kháng độc tố hay không.

Kết quả và giải thích

Đặc điểm Kết luận
Vùng mờ đục chỉ ở nửa không có chất kháng độc tố nhưng không có ở nửa còn lại do sự trung hòa của độc tố alpha.  Lecithinase dương tính
Vùng đục ở cả hai mặt của đĩa hoặc không có phản ứng trên thạch. Lecithinase âm tính

Báo cáo kết quả

  1. Các que Gram dương, hình thành bào tử, Catalase dương tính với lecithinase, có vùng mờ đục lớn, thuộc nhóm  cereus. Việc thiếu khả năng vận động đã khiến B. anthracis khác biệt với các thành viên khác trong nhóm.
  2. Lecithinase và lipase rất hữu ích trong việc xác định Clostridiumở cấp độ loài.
  • perfringenslà lipase âm tính và lecithinase dương tính, có thể được trung hòa bằng cách thêm chất kháng độc tố α trước khi cấy vào thạch (phản ứng Nagler).
  • sporogenesdương tính với lipase.
  • difficileđều âm tính với lipase và lecithinase.
  1. Một trực khuẩn Gram dương có phản ứng catalase âm tính, tán huyết và lecithinase dương tính là  haemolyticum.
  2. Trong số nhóm phát quang của các trực khuẩn gram âm, không lên men glucose.  putidaâm tính với lecithinase và hầu hết các phân lập P. fluorescens đều dương tính với lecithinase. Thử nghiệm này có thể thay thế cho quá trình thủy phân gelatin.
  3. Burkholderiaspp thường dương tính với lecithinase.

Cần tư vấn, đào tạo ISO 15189, ISO 17025 Mời gọi 0919 099 777

Hạn chế của thử nghiệm

  • Việc duy trì các điều kiện kỵ khí là bắt buộc.
  • Xét nghiệm lecithinase âm tính nên được so sánh với đĩa đối chứng, không được cấy vi khuẩn. Vì lecithinase có thể khuếch tán khắp toàn bộ đĩa thạch và gây khó khăn cho việc giải thích.
  • Thuốc giải độc C. perfringensloại A không đặc hiệu với  perfringens ;
  • Phản ứng Nagler dương tính cũng có thể được tạo ra bởi  bifermentans, C. sordellivà C. baratti nếu sử dụng chất cấy nặng.
  • Các que lên men không chứa glucose có thể tạo ra các vùng mờ đục nhỏ.

Nguồn

  1. Cẩm nang quy trình vi sinh lâm sàng, tái bản lần thứ tư. (2016). Trong  Cẩm nang Quy trình Vi sinh Lâm sàng, Phiên bản thứ tư. Hiệp hội vi sinh vật học Hoa Kỳ. https://doi.org/10.1128/9781555818814

BÀI VIẾT LIÊN QUANXEM THÊM