Thử nghiệm khả năng đông huyết tương

1915

Thử nghiệm khả năng đông huyết tương của vi khuẩn do tác dụng của men coagolase. Ứng dụng của thử nghiệm này là phép thử đặc hiệu để phân biệt các loài trong giống Staphylococcus: S. aureus (thường +), với S. epidermidis (-) và S. saprophyticus (-). Kết quả dương tính thường được coi là tiêu chuẩn chẩn đoán cuối cùng để định danh Staphylococcus và là chỉ thị về tính gây bệnh.

Cơ chế của thử nghiệm khả năng đông huyết tương

Men staphylocoagulase do Staphyloscocous tạo ra khá bền nhiệt, chịu được 60o C/30 phút.

Men có bản chất protein, được các chủng S. aureus ở người tiết ra ngoại bào. Dễ dàng bị bất hoạt hóa bởi các men phân giải protein (protease). Tuy chưa rõ về cấu trúc hóa học và cơ chế chính xác của staphylocoagulase. Nhưng có nhiều giả thiết được nêu ra về cơ chế tác động của men này. Dưới đây là một số giả thiết đó.

Như đã biết, coagulase có vai trò trong sự đông kết. Nó tác động lên vài hợp phần có trong huyết tương và tạo ra những khối đông. Trong điều kiện in vitro. Coagulase làm tăng mức độ đông huyết tương, tạo nên những sản phẩm cuối là khối đông kết dạng sợi.

Huyết tương → (men coagulase của VSV) →  Khối đông

Cơ chế thông thường của quá trình đông huyết tương có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau

Prothrombin → (Ca”, thromboplastin (men thrombokinase))   →Thrombin

Fibrin  →Thrombin  →Fibrin (khối đông)

Coagulase có thể có hai cơ chế tác động luân phiên khác nhau. Hoặc như men hoặc như chất kích hoạt cho một hợp phần trong huyết tương để biến fibrinogen thành fibrin.

Coagulase là một chất giống prothrombin. Có khả năng tác động lên những yếu tố bình thường của huyết tương  sinh ra một chất giống thrombin. Chất này đến lượt mình lại biến fibrinogen thành fibrin.

Quá trình đông huyết tương xảy ra theo hai bước

  • Phản ứng giữa men do vi sinh vật tạo ra một loại tiền- coagulase (procoagulase) với một yếu tố hoặc một chất kích hoạt có trong huyết tương tạo nên coagulase.
  • Sự đông kết thực sự của huyết tương do tác động của coagulase. Yếu tố vi sinh vật thực sự là procoagulase. Yếu tố huyết tương là một phân đoạn globulin giống – nhưng không đồng nhất – với prothrombin

Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com

Phương pháp thử thử nghiệm khả năng đông huyết tương

Chuẩn bị

Hóa chất thử: huyết tương hoặc fibrinogen.

Huyết tương nên dùng huyết tương người hoặc thỏ vô trùng, tươi hoặc đông khô (dạng thương mại). Huyết tương tươi thu được bằng cách quay ly tâm máu tươi có chứa chất chống đông. Huyết tương đông khô đã pha nên dùng ngay trong ngày.

Fibrinogen: có thể chế bằng cách trộn huyết tương tươi với nước muối bão hòa theo tỷ lệ 1:1. Để fibrinogen lắng tủa rồi quay ly tâm. Pha một phần fibrinogen tủa với 4 phần nước cất vô trùng, bảo quản trong bình chứa vô trùng.

Fibrinogen hữu hiệu khi thử trên lam lẫn trong ống nghiệm thậm chí với nồng độ pha loãng 1:160. Trước khi dùng huyết tương hoặc fibrinogen chứa citrate nên bổ sung heparin để tránh gây phản ứng coagulase dương tính giả chậm do các vi sinh vật có khả năng dùng citrate (chất chống đông) làm đông huyết tương.

Dùng 5 đơn vị heparin/1ml huyết tương chứa citrate để ức chế sự đông do vi sinh vật dùng citrate. Kiểm tra chất lượng huyết tương và fibrinogen bằng các chủng dương tính (S. aureus) và âm tính (S. epidermidis).

Một thủ thuật khác để kiểm tra khả năng đông của huyết tương là phản ứng calci hóa. Nhỏ một giọt dung dịch calcium chloride CaCl, 5% vào 0,5ml dung dịch huyết tương (độ pha loãng 1:2).  Quan sát sự đông kết xảy ra.

Bảo quản huyết tương

Huyết tương đông khô được bảo quản ở 4°C. Huyết tương đã pha không nên giữ qua ngày, có thể giữ ở 4°C vài ngày và dùng nếu không thấy dấu hiệu bị nhiễm.

Nhiệt độ tốt nhất nếu phải bảo quản huyết tương là –20°C. Nhiều người cho rằng không nên làm đông đá huyết tương dùng cho phép thử này. Có bằng chứng cho thấy khả năng đông kết của huyết tương không bị ảnh hưởng bởi việc làm đông đá.  Chỉ cần kiểm tra lại chất lượng trước khi sử dụng.

Tính ổn định của mọi chất phản ứng, huyết tương (tươi, khô, đông đá) và fibrinogen biến động theo lô. Cần kiểm tra để loại trừ chất bị giảm hoặc mất hoạt tính bằng các chủng dương tính đã biết.

Các yếu tố huyết tương ở các loài động vật không giống nhau xét theo khả năng gây đông huyết. Hầu hết các men coagulase gây đông huyết tương của người, thỏ, ngựa, heo. Nhưng không gây đông huyết tương bò, gà, cừu, chuột. CRF cao nhất trong huyết tương người, giảm dần ở heo, thỏ, ngựa và thấp nhất ở bò, gà, cừu.

Tiêu chuẩn của huyết tương dùng trong phép thử coagulase

  •  Phải chứa đủ nồng độ CRF và fibrinogen,
  • Không có hoạt tính phân giải fibrin
  • Không chứa các chất ức chế.

Sự phân giải của fibrin xảy ra dưới tác động của fibrinolysin (plasmin) hình thành khi một số yếu tố. của vi sinh vật (như staphylokinase) tác động lên hệ thống tạo fibrinolysin. có trong huyết tương. Hoạt động của hệ thống này cần được loại trừ trong huyết tương dùng để thử.

Do tác dụng ức chế của các kháng thể trong huyết tương người lên khả năng tạo coagulase của Saureus.  nuôi trên môi trường thạch. Nhiều khuyến cáo nên dùng huyết tương người pha loãng. và thử bằng các dòng thuần được nuôi cấy trên môi trường lỏng.

Hiện nay thay vì citrate người ta thường dùng EDTA làm chất chống đông trong các huyết tương đông khô. Để thử vi sinh vật bởi loại trừ được phản ứng dương tính giả do các vi sinh vật dùng citrate gây ra.

Để phát hiện men staphylocoagulase. Dùng huyết tương chứa oxalate hoặc citrate vì calci không tham gia vào hoạt động của các men này.

Men staphylocoagulase sẽ làm đông huyết tương bất kể chất chống đông trong nó là gì. Oxalate, citrate hay heparin, và sự đông kết xảy ra cả ở nồng độ huyết tương pha loãng tới 1:100. với yếu tố giới hạn chủ yếu là lượng fibrinogen mà nó chứa.

Phương pháp thử nhanh

Phương pháp thử trên lam để phát hiện coagulase liên kết.

  • Nhỏ một giọt nước cất hoặc nước muối sinh lý lên một lam kính sạch.
  • Dùng khuyên cấy lấy một lượng lớn tế bào cần kiểm trên thạch hoặc từ canh trùng của dòng thuần.
  • Hòa nhẹ vào giọt nước tạo huyền phù nồng độ cao.
  • Thêm vào đó một khuyên cấy chứa huyết tương người mới pha. Hỗn dịch phải có dạng đồng nhất (nhẫn, đều).
  • Thực hiện đồng thời hai đối chứng trên cùng lam kính đó.
  • Quan sát sự hình thành tức thời chất kết tủa trong dạng những đám ngưng kết màu trắng.
  • Phản ứng dương tính xuất hiện trong khoảng 5-20 giây.
  • Nếu sự ngưng kết không xảy ra sau 4 phút, phản ứng được coi là âm tính.

Phương pháp này chỉ nhằm đánh giá sơ bộ. Mọi kết quả âm tính cần được khẳng định bằng phương pháp thử trong ống nghiệm.

Cần kết hợp một lượng lớn vi sinh vật với một lượng nhỏ huyết tương. Mức độ ngưng kết phụ thuộc vào tỷ lệ nồng độ giữa huyết tương và vi sinh vật.

Nếu huyết tương được pha loãng trước khi dùng, tốc độ phản ứng dương tính sẽ giảm. Nồng độ tương đương (1+1) giữa huyết tương (không pha loãng) so với lượng vi sinh vật thường tạo ngưng kết tức thì (sau 5-6 giây).

Cần phải trộn khuẩn lạc nghi ngờ vào nước trước khi thêm huyết tương. Mọi sự kết tủa hoặc ngưng kết xảy ra lúc đó là do cơ chế tự ngưng kết của vi sinh vật chứ không do coagulase.

Đọc kết quả

Dương tính: Có ngưng kết rõ rệt sau 5-20 giây hoặc từ 20 giây đến hai phút. Nếu ngưng kết xảy ra sau một phút, lặp lại phép thử trên lam. Nếu kết quả vẫn như cũ chuyển sang thử trong ống nghiệm.

Âm tính: Không có ngưng kết, hỗn dịch vẫn đồng nhất. Khẳng định bằng cách thử trong ống nghiệm.

Lưu ý

  • Đối với phương pháp thử trên lam nên dùng huyết tương người tươi. Để kiểm tra hình thái vi khuẩn cho kết quả dương tính không cần nhuộm gram.  Chỉ cần nhuộm bằng crystal violet.
  • Không nên thử bằng khuẩn lạc lấy từ môi trường có chất ức chế như muối (Mannitol Salt Agar), tellurite (Baird Parker)…
  • Cần cấy chuyển trước sang môi trường phục hồi (như BHI, Nutrient Agar).

Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com

Phương pháp thử trong ống nghiệm

  • Cho vào ống nghiệm 13 × 100 mm 0,5ml huyết tương người hoặc thỏ không pha loãng.
  • Thêm 0,5ml dịch nuôi cấy dòng thuần hoặc một khuyên cấy lớn khuẩn lạc từ môi trường thạch.
  • Nếu dùng ống nghiệm 10 × 75 mm có thể giảm một nửa lượng huyết tương và dịch nuôi cấy.
  • Xoay nhẹ (không lắc) ống để trộn đều vi sinh vật, ủ ở 37oC, quan sát sau mỗi 30 phút liên tục 4 giờ.
  • Khi xem chỉ nghiêng nhẹ (không lắc) ống nghiệm.
  • Sau 4 giờ nếu không thấy khối đông, ủ tiếp đến 24 giờ.

Đọc kết

Dương tính (A): Có khối đông hình thành (toàn bộ hay một phần dịch mẫu).

Âm tính (B): Không hình thành khối đông, dịch mẫu vẫn giữ nguyên dạng lỏng (giống như mẫu chưa ủ).

Nhiều tài liệu đề nghị những nồng độ pha loãng huyết tương khác nhau khi dùng canh trùng và dùng khuẩn lạc: 1/4 và 1/5; 1 (giữ nguyên) và 1/2; 1/2 và 1/10.

Có tác giả cho rằng kết quả ngưng kết tốt nhất thu được khi dùng huyết tương không pha loãng và dịch nuôi cấy theo tỷ lệ 1+1.

Lưu ý

Không lắc ống khi đọc kết quả vì có thể làm vỡ khối đông ở giai đoạn mới hình thành. Khối đồng sẽ không tái tạo được khi ủ thêm.

Một số chủng S. aureus sinh ra một lượng lớn fibrinolysin khiến không tạo được khối đông.  Do fibrin bị phân giải sớm hoặc chỉ tạo những khối đông nhỏ nhanh chóng tan đi sau đó. gây phản ứng âm tính giả. Điều này có thể gặp khi dùng huyết tương thỏ. Chính vì vậy cần kiểm tra sự hình thành của khối đông sau mỗi 30 phút, đặc biệt trong giờ ủ đầu tiên.

Vài chủng Saureus sinh rất ít staphylocoagulase, khả năng gây đông chỉ quan sát được sau 24 giờ ủ.

Lưu ý chung

  • Phép thử coagulase dựa trên giả định cơ bản coi staphylocoagulase là nguyên nhân duy nhất gây đông huyết tương thông qua staphylothrombin.
  • Trong thực tế các men ngoại bào phân giải protein do staphylococci tiết ra còn có thể kích hoạt và biến prothrombin thành thrombin tạo fibrin (gây phản ứng đồng huyết tương giả), biến profibrinolysin thành fibrinolysin phân giải fibrin (gây phản ứng âm tính giả).
  • Đây là những phản ứng không do staphylocoagulase gây ra. Để loại trừ những phản ứng này nên bổ sung chất ức chế các men phân giải protein như hirudin. Chất kháng thrombin – 50 đơn vị/ml huyết tương với aprotinin (chất kháng fibrinolysin – 100 đơn vị/ml huyết tương).
  • Không nên dùng staphylocoagulase như một tiêu chuẩn về tính gây bệnh. Về mặt này các triệu chứng bệnh lý có ý nghĩa hơn.
  • Canh trùng quá già hoặc khuẩn lạc mọc yếu có thể cho kết quả không rõ rệt.
  • Bản thân huyết tương tươi không bền và có thể tự động kết hoặc tạo những hạt nhỏ gây đục khiến khó đọc kết quả dương tính yếu.
  • Không nên lọc huyết tương dùng thử coagulase vì có thể làm mất đi các yếu tố gây đông máu.
  • Phản ứng được coi là dương tính khi có sự đồng kết ở bất kỳ mức độ nào. Từ khối xốp di động khi nghiêng ống đến khối đặc gắn chặt vào đáy ống. Tuy nhiên nếu dùng coagulase như phép thử duy nhất để định danh Saureus có tác giả đề nghị 4 mức đánh giá sự đồng kết: 1+ đến 4+. Chỉ có mức 3+ và 4+ mới được coi là mang tính khẳng định. Với các mức thấp hơn cần làm các phép thử bổ sung (như lên men mannitol, thermonuclease).
  • Một số chủng Staphylococcus coagulase (+) cho kết quả dương tính sau 2-4 giờ, sau đó lại cho kết quả đảo ngược (làm tan khối đóng).

Xem thêm

Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm citrate

 

Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin).