Thử nghiệm citrate

2823

Thử nghiệm citrate nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường. Phép thử citrate dùng để phân biệt nhóm Klebsiella, Enterobacter (+) với E. coli (-) như trong nghiệm pháp IMViC, hoặc Edwardsiella (-) với Salmonella (+).

Cơ sở sinh hóa thử nghiệm citrate

Một số vi sinh vật sử dụng citrate như một nguồn carbon duy nhất để lấy năng lượng mà không cần dùng quá trình lên men hoặc sinh acid lactic. Việc biến dưỡng citrate do kết hợp của acetyl với coenzyme A và oxalacetate để tham gia chu trình Krebs.

Đa số vi sinh vật biến dưỡng citrate nhanh chóng nhờ chu trình acid tricarboxylic hoặc theo con đường lên men citrate. Ở một số vi sinh vật sự phân cắt citrate là do hoạt động của một hệ men. mà không có sự can thiệp của coenzyme A.

Men này được gọi là citritase (citrate oxalo acetate-lyase) hay citrate demolase. Để hoạt động men cần có một cation hóa trị hai, thường là Mg hoặc Mn. Trước đây người ta nghĩ rằng sự phân cắt sơ khởi của citrate sinh ra oxalacetate và acetate.

Hiện nay người ta coi oxalacetate và acetate chỉ là những sản phẩm trung gian trong quá trình biến dưỡng citrate. Các sản phẩm thu được do biến dưỡng citrate phụ thuộc vào pH của môi trường.

Lưu ý

Nếu pH tăng lượng acetate và formate hình thành sẽ tăng kèm theo sự giảm lượng lactate và CO2. Với pH khoảng 7,0 lactate sẽ không hình thành và sản phẩm sẽ là:

Citrate  →   CO2+2 acid acetic

Ở pH acid acetoin và lactate sẽ là những sản phẩm chủ yếu của việc dùng citrate. Cho dù các sản phẩm cuối là gì, bước đầu tiên trong việc lên men citrate vẫn là sự hình thành pyruvate.

Citrate  →  oxalacetate + acetate

Oxalacetate     →   pyruvate + CO2

Sự phân giải tiếp theo của pyruvate phụ thuộc vào pH của môi trường

Môi trường kiềm:

Pyruvate  →   acetate + formate

* Môi trường acid:

2 pyruvates →  acetate + CO2 + lactate

2 pyruvates →  acetoin + 2 CO2

Việc sử dụng các acid hữu cơ và muối của chúng (hình thành từ citrate). làm nguồn carbon sẽ sinh ra các carbonate và bicarbonate có tính kiềm làm môi trường bị kiềm hóa. Ngoài ra môi trường dùng để lên men citrate còn chứa muối ammonium hữu cơ.

Mọi vi sinh dùng citrate như một nguồn carbon duy nhất đều có thể dùng muối ammonium như nguồn nitrogen duy nhất (và ngược lại).

Muối ammonium khi bị phân hủy sinh NH, cũng làm kiềm hóa môi trường. Như vậy thử nghiệm citrate dùng khả năng phân giải ammonium sinh NH, làm chỉ thị.

Phương pháp thử

Môi trường

Simmons Citrate Agar (SCA). pH 6,9. Chất chỉ thị pH: bromothymol blue. Có thể dùng sodium citrate hoặc potassium citrate làm nguồn carbon.

  • Acid: màu vàng, (không thấy được), pH 6,0.
  • Kiểm: màu xanh dương, pH 7,6;
  • Trung tính (mỗi trường không nuôi cấy): màu xanh luc, pH 6,9.

Cấy ria khuẩn lạc thuần từ KIA hoặc môi trường khác thích hợp 18-24 giờ lên mặt thạch nghiêng. Không cấy quá dày, ủ ở 35°C/24-48 giờ, khi cần có thể đến 4 ngày.

Christensens Citrate Sulfide Agar (CCSA), pH 6,7, thử khả năng dùng citrate khi có nitrogen hữu cơ là cystein.

Nếu không định thử khả năng sinh H2S có thể loại ferric ammonium citrate và sodium thiosulfate khỏi môi trường. Vì chúng không ảnh hưởng gì lên khả năng dùng citrate.

Chất chỉ thị pH: phenol red. Acid: màu vàng, pH 6,8. Kiểm: màu đỏ, pH 8,4.

Môi trường không cấy: pH 6,7, màu kem đến nâu. Cách ủ như môi trường Simmons citrate agar.

Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com

Đọc kết quả

  • SCA

Dương tính: có khuẩn lạc, môi trường chuyển sang màu xanh dương.

Âm tính: không có khuẩn lạc, môi trường giữ nguyên

màu lục.

  • CCSA

Dương tính: màu đỏ trên mặt thạch nghiêng.

Âm tính: môi trường không đổi màu.

 

Phương pháp thử nhanh – Phép thử citrate có chứa máu

Nguyên tắc

Thử khả năng của vi sinh vật sử dụng citrate đang dùng làm chất chống đông trong máu. Citrate chống đông do kết hợp với calci là một yếu tố gây đông. vi sinh vật citrate (+) sử dụng citrate giải phóng calci làm đông máu.

Môi trường

Brain Heart Infusion Broth (BHI).

Thêm (vô trùng) 15ml máu không đông do chứa citrate vào 85ml dung dịch BHI đã khử trùng và làm nguội. Trộn đều và lấy 1ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm vô trùng. Cấy vào ống một khuyên dày khuẩn lạc 18 giờ từ TSI. Ủ ở 35°C 1-3,5 giờ, có thể kéo dài đến 6,5 giờ. Theo dõi kết quả sau mỗi giờ.

 Đọc kết quả

  •  Dương tính – tạo thể ngưng kết chặt.
  • Âm tính – không có ngưng kết, môi trường vẫn đồng nhất.
  • Không nên dùng nước muối sinh lý hoặc có chứa glucose (sẽ kéo dài thời gian ngưng kết).
  • Một lượng muối nhỏ (2,5 g/l) được cho vào môi trường để tránh phân giải tế bào. Dùng máu nguyên tốt hơn huyết tương do không cần ly tâm và thời gian ngưng kết nhanh hơn.

Lưu ý:

  • Cường độ màu sinh ra trong các phép thử dương tính có thể khác nhau. do sự khác biệt giữa các chất chỉ thị pH tùy theo lô hàng.
  • Nếu cấy dày có thể sinh màu kem hoặc màu vàng trên thạch nghiêng. Nhưng không ảnh hưởng đến màu môi trường bên dưới. Màu này không được coi là dương tính. Nếu cấy quá dày đặc có thể gây kết quả dương tính giả.
  • Khi cấy một nhóm thử sinh hóa từ cùng một thể nuôi cấy cần đốt kim. hoặc khuyên cấy trước khi cấy lên môi trường citrate, hoặc cấy môi trường này đầu tiên.

Mọi sự sang nhiễm glucose hoặc các chất dinh dưỡng khác vào môi trường citrate đều có thể gây phản ứng dương tính giả. Nên hòa thể nuôi cấy vào nước muối sinh lý trước khi cấy thử citrate để tránh sang nhiễm những nguồn carbon khác.

  • Sau 24 giờ ủ vi sinh vật citrate dương có thể thể hiện tính kiềm hóa rất nhẹ, phớt hiện trên mặt thạch nghiêng. Nếu nghi ngờ cần so sánh với ống citrate không cấy. Một số vi sinh vật citrate dương tính đòi hỏi thời gian ủ 48 giờ hoặc hơn để làm thay đổi pH.

Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com

Xem thêm: thử nghiệm catalase

Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin).