1.NGUYÊN TẮC CHUẨN BỊ MẪU VI SINH
-
- Chuẩn bị huyền phù ban đầu sao cho vi sinh vật phân bố đều trong dịch đồng nhất mẫu.
- Huyền phù tăng sinh/tiền tăng sinh mẫu được pha loãng tương tự với canh trường theo như khuyến nghị ở từng phương pháp cụ thể.
- Chuẩn bị dãy pha loãng bậc 10 làm giảm mật độ vi sinh vật trong mẫu đến ngưỡng có thể đếm được.
- Nếu mẫu được dự đoán có số lượng vi sinh vật cao, chỉ thực hiện cấy ở những độ pha loãng thích hợp (ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp) cho kết quả đếm được.
2.THUẬT NGỮ VÀ ĐỊNH NGHĨA – CHUẨN BỊ MẪU VI SINH
-
-
- Huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10-1): một đơn vị khối lượng/thể tích mẫu hòa loãng với 9 đơn vị thể tích dịch pha loãng, không tính phần chất rắn của mẫu lắng tách.
- Dãy pha loãng bậc 10: trộn lẫn 1 đơn vị thể tích huyền phù ban đầu (10-1) với 9 đơn vị thể tích dịch pha loãng, và lặp lại quá trình tương tự quá trình với các huyền phù sau (độ pha loãng 10-2, …, 10-n).
- Mẫu phân tích: được lấy từ mẫu gửi để chuẩn bị huyền phù ban đầu, được lấy với một lượng mẫu xác định và đại diện cho mẫu gửi.
-
3.DỤNG CỤ, THIẾT BỊ
-
-
-
- Nồi hấp thanh trùng
- Tủ sấy tiệt trùng
- Máy dập mẫu/xay mẫu
- Pipette
- Cân
- Máy đo pH
- Kéo, kẹp inox
- Túi dập mẫu
-
-
4.MÔI TRƯỜNG HÓA CHẤT
-
-
-
-
- Dung dịch peptone salt
- Buffered peptone water
- dịch muối peptone với Bromocresol purple
-
-
-
5.PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MẪU VI SINH
-
-
-
-
-
- Chuẩn bị mẫu phân tích và huyền phù ban đầu
-
-
-
-
- Với mẫu phân tích định tính: cân 25 ± 0.5 g mẫu vào túi vô trùng và thực hiện pha loãng 10 lần với môi trường tăng sinh tương ứng theo hướng dẫn của phương pháp cụ thể.
- Với mẫu phân tích định lượng: cân một khối lượng mẫu m (g): 10 – 50 g vào túi đựng mẫu vô trùng. Độ không đảm bảo cho phép (U) của phép cân là ± 5%. (Cách lấy mẫu cho từng nhóm đối tượng cụ thể, xem hướng dẫn ở Mục 7.5, 7.6, 7.7, và 7.8)
- Bổ sung một lượng dịch pha loãng 9 x m (g) để tạo dịch huyền phù 1/10. Độ không đảm bảo cho phép của phép cân là ± 5%.
- Dịch pha loãng được đưa về nhiệt độ phòng khi thực hiện pha loãng.
- Đồng nhất hỗn hợp mẫu và dịch pha loãng trong vòng 2 phút.
- Giữ yên trong vòng 15 phút để phần chất thô mẫu lắng xuống.
- Nếu thực hiện đếm số bào tử vi sinh vật, dịch mẫu cần được xử lý nhiệt ở 80 oC trong 10 phút ngày sau khi pha loãng, sau đó làm nguội nhanh.
-
Tạo dãy pha loãng bậc 10 cho mẫu phân tích định lượng
-
- Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng và đánh số 10-2, 10-3,…, 10-n.
- Cấy chuyển 1 mL huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10-1) vào ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng (ống nghiệm 10-2).
- Vortex 5 – 10 giây để trộn đều, có được huyền phù đồng nhất ở độ pha loãng10-2.
- Rút 1 mL huyền phù 10-2 cấy vào 9 mL ống dịch pha loãng 10-3.
- Vortex 5 – 10 giây để trộn đều, có được huyền phù đồng nhất ở độ pha loãng10-3
- Lặp lại quá trình tương tự cho những độ pha loãng sau (10-4, 10-5,…,10-n).
Lưu ý:
- Sắp xếp dãy ống nghiệm pha loãng trên giá ống nghiệm theo thứ tự hợp lý để tránh nhầm lẫn giữa các độ pha loãng của cùng mẫu và của các mẫu khác nhau.
- Tránh nhiễm chéo do đầu tip pipette chứa vi sinh vật với dịch pha loãng vô trùng.
- Không đưa đầu tip pipette vào sâu hơn 1 cm trong huyền phù mẫu.
Cần tư vấn đào tạo về ISO 17025, tư vấn thiết kế xây dựng phòng thí nghiệm, tư vấn đào tạo 5S, cải tiến năng suất chất lượng mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Chọn độ pha loãng thích hợp cho từng đối tượng phân tích
- Việc chọn độ pha loãng thích hợp cho mỗi nhóm, loại thực phẩm phân tích phụ thuộc vào mức độ nhiễm tự nhiên của từng loại mẫu (mẫu thịt tươi thường nhiễm khuẩn nhiều hơn mẫu thủy sản) và mức độ chế biến, xử lý của mẫu thực phẩm (mẫu thành phẩm ít nhiễm hơn mẫu nguyên liệu và mẫu bán thành phẩm) và cách thức bảo quản.
- Chọn độ pha loãng thích hợp cho từng loại mẫu thực phẩm theo bảng dưới (có thể thay đổi tùy theo đánh giá về tình trạng mẫu lúc vào phòng thí nghiệm):
Bảng chọn độ pha loãng
| Mẫu thực phẩm | Hình thức chế biến và bảo quản | Độ pha loãng đề nghị |
| Sushi, sashimi thủy hải sản và các sản phẩm không qua xử lý nhiệt trước khi dùng | Thành phẩm đóng gói | – TPC: 10-1, 10-2
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-1
|
| Thủy hải sản làm sạch (bỏ ruột, có hoặc không có da) | Thành phẩm, đông lạnh | – TPC: 10-2, 10-3
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-1 |
| Thủy hải sản còn da, vỏ, ruột nguyên con hoặc cắt khúc | Bán thành phẩm hoặc nguyên liệu tươi hoặc ướp đá | – TPC: 10-3, 10-4, (10-5)
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-1, 10-2 |
| Thịt tươi nguyên khối (heo, bò, gà) | Bảo quản 2 – 8 oC | – TPC: 10-5, 10-6, (10-7)
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-2, 10-3 |
| Thịt xay (heo, bò, gà) | Bảo quản 2 – 8 oC | – TPC: 10-6, 10-7, (10-8)
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-2, 10-3, (10-4) |
| Bột ngũ cốc | Đóng gói, bảo quản 15 – 30 oC | – TPC: 10-2, 10-3, (10-4)
– Các chỉ tiêu định lượng khác và nấm mốc: 10-1, 10-2 |
| Sữa bột | Thành phẩm đóng gói | – TPC: 10-1, 10-2
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-1 |
| Rau (không lấy phần rễ) | Tươi, bảo quản 2-8 oC | – TPC: 10-2, 10-3, 10-4
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-1, 10-2 |
| Các loại thực phẩm khác | Thành phẩm đóng gói | – TPC: 10-2, 10-3, (10-4)
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-1, (10-2) |
| Các loại thực phẩm khác | Nguyên liệu | – TPC: 10-3, 10-4, 10-5, (10-6)
– Các chỉ tiêu định lượng khác: 10-2, 10-3 |
Lưu ý: Độ pha loãng đặt trong dấu “()” có thể chọn hoặc không, tùy vào đánh giá tình trạng mẫu khi nhận.
Tổng thời gian phân tích cho phép của quá trình
- ≤ 45 phút: khoảng thời gian cho phép kéo dài từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi cấy mẫu.
- ≤ 30 phút: khoảng thời gian cho phép từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến huyền phù có độ pha loãng kế tiếp.
- Nguyên tắc chung chuẩn bị mẫu (xử lý ban đầu)
- Mẫu đông lạnh
- Rã đông mẫu ở 18 – 27 oC không quá 3 giờ hoặc ở 2 oC ± 2 oC không quá 24 giờ.
- Có thể dùng dịch pha loãng hỗ trợ rã đông mẫu.
- Mẫu cứng và khô
- Xay nhuyễn mẫu không quá 1 phút, tránh làm tăng nhiệt độ mẫu quá cao.
- Mẫu lỏng (không có tính nhớt)
- Lắc chai đựng mẫu 25 lần trước khi phân tích.
- Mẫu hỗn hợp
- Lấy mẫu đại diện, phản ánh đúng tình trạng của mẫu thực về thành phần và tỷ lệ tương đối giữa các thành phần.
- Hoặc có thể đồng nhất toàn bộ mẫu (xay nhuyễn trong vòng 1 phút) rồi lấy mẫu.
- Các sản phẩm có tính acid
- Dùng dịch pha loãng có chứa chỉ thị pH và dung dịch NaOH để trung hòa mẫu.
- Bổ sung NaOH (0.1M hoặc 1M) vào dịch pha loãng có chứa hệ đệm để làm tăng khả năng đệm.
- Thực phẩm giàu béo (hàm lượng béo trên 20% tổng lượng chất thô)
- Bổ sung sorbitan monooleate Tween 80 (1 g/l – 10 g/l, tùy hàm lượng béo) vào dịch pha loãng để cải thiện độ nhũ tương khi huyền phù.
- Chuẩn bị mẫu thủy hải sản
-
Dạng nguyên liệu tươi
-
- Chuẩn bị mẫu thủy hải sản
- Nguyên tắc chung chuẩn bị mẫu (xử lý ban đầu)
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Cá nguyên con
|
|
| Mực, bạch tuộc nguyên con |
|
| Giáp xác nguyên con (cua) |
|
| Giáp xác (tôm, tôm hùm) |
|
| Nhuyễn thể sống và các loại thân mềm khác |
|
| Hai mảnh vỏ |
|
| Gastropods |
|
| Sea urchins |
|
| Holothurians & tunicates |
|
Dạng chế biến
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Muối hoặc ngâm giấm |
|
| Cá khô, cá muối |
|
| Cá nguyên con xông khói |
|
| Fillet/lát xông khói |
|
Dạng đông lạnh
| Tôm lột đông block |
|
| Tôm nguyên con đông block |
|
| Thịt cua, thân mềm nguyên con, nhuyễn thể lột vỏ đông block |
|
| Cá fillet, lát lớn đông block |
|
| Cá ngừ nguyên con đông lạnh |
|
| Cá nguyên con hoặc cắt miếng đông |
|
Chuẩn bị mẫu thịt và các sản phẩm từ thịt
-
Dạng sản phẩm chế biến
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Đóng gói |
|
| Lát thịt lớn |
|
| Toàn bộ khối thịt sống/tươi |
|
Cần tư vấn đào tạo về ISO 17025, tư vấn thiết kế xây dựng phòng thí nghiệm, tư vấn đào tạo 5S, cải tiến năng suất chất lượng mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
-
Dạng sản phẩm đông lạnh
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Lấy mẫu toàn bộ (bề mặt và phần sâu) |
|
| Mẫu nhỏ đã rã đông |
|
- Các sản phẩm khác
-
Bột, hạt ngũ cốc, phụ phẩm ngũ cốc, thức ăn gia súc
-
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Dạng bột |
|
| Ngũ cốc và sản phẩm hỗn hợp |
|
Các sản phẩm rât cứng
- Lấy nhiều mẫu hơn lượng cần phân tích, đập vỡ, xay nhỏ bằng búa và cho vào túi mẫu.
- Cân và pha loãng mẫu 1/10 với nước peptone salt.
- Để yên 20 – 30 phút ở nhiệt độ 18 – 27 o
- Xay mẫu 1 phút.
- Gelatine
- Lấy 20 mẫu vào chai vô trùng, bổ sung 180 mL phosphate buffered diluents, trộn đều.
- Để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đặt chai vào bể điều nhiệt ở 45 oC trong 30 phút, khuấy liên tục đến khi gelatin hòa tan.
- Bơ magarine và spread
-
Lấy mẫu
-
- Bơ magarine và spread
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Trước khi đóng gói từ khối trên 1 kg |
|
| Mẫu dưới 1kg
(gồm nhiều mẫu nhỏ) |
|
Chuẩn bị mẫu phân tích Vi sinh
- Cân 40 g mẫu vào chai vô trùng.
- Chuẩn bị huyền phù ban đầu:
- Bổ sung 1 lượng dịch pha loãng tương đương với lượng chất béo có trong mẫu (magarine: 82%, tương đương bổ sung 33 mL dịch).
- Đặt chai mẫu vào bể điều nhiệt 45 oC đến khi mẫu tan chảy hoàn toàn (khoảng 20 phút).
- Lắc mẫu kết hợp khuấy trộn đến khi thu được nhũ tương đồng nhất (khoảng 2 – 5 phút tùy loại sản phẩm).
- Để yên ở nhiệt độ phòng đến khi mẫu phân tách riêng lớp chất béo (bên trên) và pha lỏng bên dưới (được xem là mẫu kiểm, 1 mL tương đương với 1g magarine).
- Dịch pha lỏng được dùng để pha loãng tạo huyền phù ban đầu.
Sản phẩm khử nước
- Các dạng mẫu khử nước gồm:
- Rau, thịt, súp sấy khô;
- Nước uống dạng bột: trà, coca, café, chocolate, bột trái cây;
- Cellulose thô, tinh bột tan, dextrin, sorbitol, đường, glucose, glutamate;
- Thảo mộc, gia vị, hương liệu, chất màu;
- Gum, chất gel polysaccharide;
- Dịch chiết cơm dừa, nấm men, trứng sấy, v.v.
- Với sản phẩm dạng bột, trộn kỹ mẫu trong dụng cụ chứa trước rồi cân mẫu.
- Các sản phẩm khác: cắt nhỏ, làm vỡ thành mảnh nhỏ trước khi phân tích.
Các dạng khác
| Loại sản phẩm | Cách lấy mẫu |
| Dạng bột, tan |
|
| Không phải dạng bột |
|
| Dạng háo nước |
|
| Dạng chứa nhiều chất ức chế/bảo quản |
|
| Chocolate |
|
Sản phẩm từ trứng
-
- Trứng tươi nguyên quả
- Trứng phải còn nguyên, không nứt vỡ.
- Nếu kiểm tra phần bên trong, khử trùng vỏ trứng trước khi làm vỡ:
- Dùng khăn giấy lau bụi bẩn hoặc phân bên ngoài, rửa nước, lau khô.
- Dùng khăn tẩm isopropanol lau vỏ trứng, để khô.
- Nếu kiểm tra vi sinh vật gây bệnh (có thể hiện diện ở phần vỏ), không cần khử trùng.
- Phân tích hệ vi sinh vỏ trứng: không làm vỡ vỏ
- Dùng 1 thể tích dịch pha loãng đã biết rửa vỏ trứng và thu dịch. Dịch này được xem là huyền phù ban đầu;
- Hoặc đặt trứng vào túi mẫu có chứa 1 lượng dịch pha loãng đã biết, rửa và bỏ quả trứng.
- Phân tích hệ vi sinh lòng trứng:
- Dùng găng tay vô trùng đập vỏ trứng. Nếu có thể, tách riêng lòng trắng và lòng đỏ vào 2 túi mẫu riêng.
- Pha loãng với peptone salt: lòng đỏ (pha loãng 1/10); lòng trắng (pha loãng 1/41 để giảm hàm lượng chất ức chế lysozyme trong mẫu).
- Nếu phát hiện vi sinh vật trong lòng trứng, thu nhận cả lòng đỏ lẫn trắng vào 180 mL Buffered peptone water hoặc trong môi trường tăng sinh thích hợp.
- Đếm tổng số vi sinh vật (vỏ + lòng vàng + lòng trắng)
- Phá vỡ vỏ, thu nhận cả vỏ và phần bên trong quả trứng vào chai vô trùng.
- Lắc mạnh chai (bằng tay) đồng nhất mẫu.
- Lấy 1 lượng mẫu cần thiết để pha loãng tạo huyền phù ban đầu.
Sản phẩm lên men (chứa vi sinh sống)
-
-
- Hướng dẫn chung
- Chỉ phân tích vi sinh vật nhiễm, không tính vi sinh vật dùng cho quá trình lên men.
- Dịch pha loãng: peptone salt chứa Bromocresol purple.
- Nếu dịch huyền phù chuyển màu (do chỉ thị pH), bổ sung NaOH (40g/l) để đưa về pH trung tính (7.0 ± 0.2 ở 25 oC).
- Nếu mẫu chứa nấm men, bổ sung tác nhân kháng nấm (cycloheximide 50 mg/kg hoặc nystatin 50 mg/kg hoặc amphotericine 10 mg/kg) vào môi trường đếm.
- Với các trường hợp khác: nên bổ sung kháng sinh ức chế hệ vi sinh lên men. Loại và nồng độ kháng sinh phải được công cố trong báo cáo.
- Pastries và cake (từ bột, đường, bơ, trứng, sữa, trái cây)
- Lấy mẫu tương tự như trường hợp mẫu hỗn hợp.
- Riêng trường hợp bánh biscuit (bánh quy), lấy mẫu tương tự dạng mẫu khử nước.
-
Mì ăn liền
-
- Phạm vi áp dụng:
- Tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại mì ăn liền được đóng gói sẵn, có hoặc không kèm theo gói gia vị, hoặc mì đã được trộn / phun sẵn gia vị; có thể ăn liền hoặc ăn liền sau khi ngâm trong nước sôi trong thời gian xác định.
- Cách thực hiện:
- Dùng tay bẻ nhẹ gói mì, vắt mì thành miếng nhỏ.
- Mở gói, lấy toàn bộ phần phần mì khô vào máy xay mẫu. Lấy toàn bộ gói gia vị (nếu có) dạng bột hoặc sệt vào cối xay.
- Xay mẫu 45 – 60 giây.
- Dùng muỗng inox vô trùng lấy mẫu vào túi dập mẫu và tiến hành pha loãng bậc 10.
Cần tư vấn đào tạo về ISO 17025, tư vấn thiết kế xây dựng phòng thí nghiệm, tư vấn đào tạo 5S, cải tiến năng suất chất lượng mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
