NỘI DUNG
Thử nghiệm urea dùng phân biệt các dạng Proteus urea dương tính với vi khuẩn Enterobactiriaceae. Các giống khác có thể có phản ứng chậm.
Nguyên tắc thử nghiệm urease
Xác định khả năng của vi khuẩn phân giải urea tao phân tử amonia. Do tác dụng của men urea làm kiềm hóa môi trường.
Cơ sở sinh hóa
Urea là một diamide của H2CO3 gọi là carbamide. Mọi amide đều dễ dàng bị thủy phân. Sự thủy phân urea được xúc tác bởi một men đặc hiệu là urea tạo 2 phân tử amonia. Trong0 dung dịch urea bị thủy phân sinh amonia carbonate.
(NH2)2CO+ 2H2O- urea – CO2 + H2O +2NH2– (NH4)2CO3
Urea là một men quan trọng cở vi khuẩn liên quan đến sự phân giải chất hữu cơ.
2 loại men có ở vi sinh vật là loại sẵn có và loại cảm ứng.
Men cảm ứng thích nghi chỉ được vi sinh vật tao ra khi xuất hiện một cơ chất đặc biệt. Urea thuộc loại men sẵn có bởi vi khuẩn tạo ra chúng không phụ thuộc và cơ chất urea có hay không.
Có hai nhóm men lớn là
Men hydrolase (men thủy phân): là men xúc tác cho quá trình phản ứng giữa nước với một phân tử tạo 2 phân tử mới. Một chứa hydro nguyên tử và một chứa nhóm OH.
Các men liên quan đến phản ứng oxy hóa khử khác nhau.
Urea là men amidase xúc tác cho sự thủy phân của các amide. Nitrogen tách ra dưới dạng amoni. Urea tác động lên mối liên kết C-N trong hợp chất. Ngoại trừ những chất chứa các mối liên kết peptide,
pH tối ưu cho hoạt động urea là 7.0.
H2N—CO—NH2
Phương pháp thử
Môi trường
Canh urea
Chỉ thị pH: Phenol red, vùng chuyển màu 6.8-8.4 từ vàng sang đỏ
Urea không bền ở nhiệt độ cao nên được thanh trùng riêng bằng màng lọc vô khuẩn. Thêm vào môi trường cơ bản đã hấp tiệt trùng. Rót vào ống nghiệm vô trùng 3mL.
Cấy đậm , lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn. Ủ 37oC, quan sát sau 8, 12, 24, 48 giờ ủ.
Phenol red chỉ thị mức giảm nồng độ ion hydro do sự hình thành 2 phân tử amonia.
Đọc kết quả
Dương tính : màu đỏ tím trong môi trường
Âm tính: không đổi màu (màu vàng cam)
Lưu ý
Mức đệm cao che lấp hoạt tính urea ở những vi sinh vật dương tính chậm. Vì vậy môi trường này chỉ dùng để thử hoạt tính urea cho những chủng dương tính mạnh.
Tùy nồng độ vi khuẩn được cấy và hoạt tính của men urea ở các chủng Proteaceae. pH ở các phản ứng dương tính có thể thay đổi.
Khi tăng lượng dịch khuẩn được cấy từ 0.01 đến 0.1 mL. Thời gian cần để pH đạt đến 8.1 sẽ giảm xuống. Tuy nhiên một thể cấy đậm hơn sẽ không đẩy nhanh hơn quá trình này. Lượng cấy chuẩn 0.1mL sẽ cho kết quả dương tính khoảng 3 giờ sơm hơn so với 0.01mL.
Lượng cơ chất hoặc thời gian ủ có thể làm thay đổi cường độ men urea ở các chủng Proteaceae dương tính.
Phản ứng âm tính giả có thể xảy ra khi lượng NH3 tạo ra quá ít để vượt qua mức đệm của môi trường. Và làm đổi màu chất chỉ thị phenol red.
Nếu ột vi sinh vật có thể thủy phân urea nhưng không dùng NH3 như nguồn Nito. Nó sẽ không phát triển và gây phản ứng âm tính giả.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Xem thêm
Thử nghiệm khả năng đông huyết tương
Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin)
