NỘI DUNG
Thử nghiệm β-galactosidase ONPG để phát hiện β galactosidase. Một loại enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hóa lactose, trong vi khuẩn đường ruột Enterobacterales.
Nguyên tắc thử nghiệm β-galactosidase ONPG
O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) có cấu trúc tương tự như lactoza. Tức là ONPG là một chất tương tự của lactoza. Ngoại trừ orthonitrophenyl đã được thay thế cho glucoza.
Khi thủy phân, nhờ hoạt động của enzyme β-galactosidase. ONPG phân cắt thành hai gốc galactose và o-nitrophenol.
ONPG là hợp chất không màu: O-nitrophenol có màu vàng, cung cấp bằng chứng trực quan về quá trình thủy phân.
Kiểm tra ONPG
Vi khuẩn lên men Lactose sở hữu cả Lactose permease và β-galactosidase. Hai loại enzyme cần thiết để sản xuất axit trong thử nghiệm lên men Lactose.
Permease cần thiết để phân tử lactoza thâm nhập vào tế bào vi khuẩn. Nơi β-galactosidase có thể cắt liên kết galactoside, tạo ra glucose và galactose.
Vi khuẩn không lên men đường sữa không có cả hai loại enzyme và không có khả năng tạo ra axit từ đường sữa.
Một số loài vi khuẩn dường như không lên men đường sữa vì chúng thiếu permease. Nhưng lại sở hữu-galactosidase và cho kết quả xét nghiệm ONPG dương tính .
Sinh vật lên men muộn đường sữa có thể bị trì hoãn trong quá trình sản xuất axit từ đường sữa do hoạt động thẩm thấu chậm.
Trong trường hợp này, thử nghiệm ONPG dương tính có thể giúp xác định nhanh quá trình lên men lactoza bị trì hoãn.
Kết quả kiểm tra ONPG so với quá trình lên men đường sữa
- Lactose lên men (ONPG Dương tính): coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp sản xuất β-galactosidase và permease
- Vi khuẩn lên men muộn đường sữa (ONPG Dương tính): Citrobacter spp, Arizona spp chỉ sản xuất β-galactosidase nên chúng lên men đường sữa chậm.
- Vi sinh vật lên men không Lactoza (ONPG Âm tính): Salmonellaspp; vi khuẩn Shigella ; Proteus spp; Providencia spp và Morganella spp không sinh β-galactosidase nên không lên men được đường lactoza.
Phương tiện và thuốc thử
- Dung dịch đệm natri photphat, 1 M, pH 7,0
- O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG), 0,75 M
- nước muối sinh lý
- toulene
Phương pháp thử
Vi khuẩn phát triển trong môi trường có chứa đường sữa (để kích thích sản xuất enzyme galactosidase). Dùng thạch TSI tạo ra kết quả tối ưu trong thử nghiệm ONPG.
Lưu ý: Enzyme β-galactosidase chỉ được tạo ra khi có cơ chất đường sữa
- Một vòng vi khuẩn phát triển được nhũ hóa trong 0,05mL nước muối sinh lý để tạo ra huyền phù nặng
- Một giọt toluene được thêm vào huyền phù và trộn mạnh trong vài giây để giải phóng enzyme cho tế bào vi khuẩn.
- Một lượng dung dịch đệm ONPG tương đương được thêm vào huyền phù.
- Hỗn hợp được đặt trong nồi cách thủy 37 oC
Đọc kết quả
Tốc độ thủy phân ONPG thành o-nitrophenol có thể nhanh đối với một số sinh vật.
Tạo ra phản ứng màu vàng có thể nhìn thấy trong vòng 5 đến 10 phút.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Xem thêm
Thử nghiệm khả năng đông huyết tương
Nguồn: microbeonline.com
